牡丹芍藥遠緣雜交親和性

芍藥科芍藥屬的牡丹與芍藥，被譽爲 “花中二傑”，是我國的傳統名花，花型多變，花色豔麗，具有較高的觀賞價值和生產價值，在國內外花卉市場中佔有重要地位。牡丹、芍藥的雜交育種始於１９ 世紀的法國，至今已有１００ 多年的歷史，通過雜交育種已選育出一系列具有較高觀賞價值、抗寒、抗病等特點的新品種，例如，著名的ｉｔｏｈ 雜種，ｉｔｏｈ雜種外形美觀，新奇芳香能滿足人們“色香兼備”的需求，是目前牡丹、芍藥中最受歡迎的類羣，許多品種現已在世界範圍內廣泛流通，雖然價格昂貴，但仍然供不應求 。

遠緣雜交是重要的變異來源，許多優良品種均來源於此。遠緣雜交是將有利性狀轉入目標材料從而獲得新物種的有效途徑，然而遠緣雜交往往存在嚴重的不親和現象。利用熒光顯微技術對植物遠緣雜交花粉與雌蕊親和性的研究已在菊屬、百合、紫薇 、杜鵑等植物中報道。

２００８ 年中國首次發現並鑑定了牡丹、芍藥遠緣天然雜交後代‘和諧’。‘和諧’具有很強的雜種優勢和較高的應用價值，‘和諧’的發現彌補了我國牡丹、芍藥組間雜交的空白。在牡丹、芍藥組間雜交育種方面僅見何桂梅 進行了雜種胚培養的嘗試研究。律春燕等通過熒光顯微觀察，研究了黃牡丹（paeonia lutea）與不同芍藥品種組間雜交花粉與柱頭的親和性。由於組間花期不遇或遠緣雜交不親和等原因， 牡丹組與芍藥組之間雜交難度大，結實率較低。因此，探討牡丹和芍藥雜交不親和的原因，對提高育種效率，培育綜合性狀優良的牡丹新品種具有重要意義。由於種間雜交結實率與親本生殖器官發育密切相關，本研究分別選取生長勢較強，瓣性較低，雌蕊發育完全，結實率較高的‘鳳丹白’ （paeonia ostii‘ｆｅｎｇｄａｎｂａｉ’）和‘粉玉奴’（paeonia lactiflora‘ｆｅｎｙｕｎｕ’）爲父母本，觀察親本花粉粒形態及雜交和母本自然授粉的結實率，並對授粉後柱頭花粉萌發和生長過程進行觀察，以探究牡丹和芍藥遠緣雜交不親和機理。#p#分頁標題#e#

1 材料與方法

試驗所用母本芍藥品種‘粉玉奴’與父本牡丹品種‘鳳丹白’均引自山東菏澤，於２０１１ 年栽植於河南農業大學三區苗圃基地，植株生長良好，可以正常開花結實。

去雄和授粉：試驗於２０１３ 年４─５ 月份進行，採集‘鳳丹白’花葯置於室內使其自然散粉，隨後收集花粉，將收集好的花粉置於裝有變色硅膠的乾燥器內，冰箱內４℃保存，定期測定花粉活力。採用離體培養法測定花粉活力，培養液爲５０ ｍｇ?ｋｇ－１ 硼酸＋１０％蔗糖，２４ ℃下培養６ ｈ。授粉前親本花粉活力大於４０％ ，可用於授粉。

於２０１３ 年４ 月下旬至５ 月上旬芍藥盛花期，每天下午選取翌日開放花蕾的母本植株進行人工去雄套袋， 第２天０９：３０─１０：３０ 進行當日授粉，並立即套袋、標記掛牌。

芍藥開花習性和柱頭可授期的確定：選擇飽滿無病蟲害的花朵在緊蕾期進行標記並跟蹤觀察，觀察並記錄花器官形態變化。分別取緊蕾期、大蕾期、開花第１、２、３、４、５、６、７、８ 天不同時期花朵的柱頭各２０ 個，在顯微鏡下觀察柱頭黏液分泌情況，記錄黏液分泌最多的時期，確定爲最佳授粉期。花粉掃描電鏡觀察： 將收集的花粉經硅膠乾燥後， 固定於樣品臺。離子濺射儀鍍金後，在日立ｓ－３４００ｎ 掃描電鏡下觀察、拍照。每次選５ 個花粉，重複３ 次、ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ｃｓ 分析和處理圖像數據。花粉萌發和花粉管伸長的熒光顯微觀察：花柱壓片參照ｋｈｏ ｅｔ ａｌ．［１７］ 的方法並加以改進。分別於授粉後８、１６、２４、４８、７２、９６ ｈ 取雌蕊放入ｆａａ 固定液中固定２４ ｈ以上，覆水（７０％酒精─５０％酒精─ ３０％ 酒精─蒸餾水）；隨後在８ ｍｏｌ?ｌ－１ ｎａｏｈ 溶液中常溫軟化處理１２ ｈ；用蒸餾水漂洗；用０．１４ ｍｏｌ?ｌ－１ｋ２ ｈｐｏ４ 的０．１％水溶性苯胺藍溶液染色６ ｈ。雌蕊壓片，在ｎｉｋｏｎ ｅｃｌｉｐｓｅ ｔｉ 型熒光顯微鏡下以紫外光爲激發光，觀察花粉和柱頭並拍照。#p#分頁標題#e#

2 結果與分析

2．1 芍藥開花習性和柱頭可授期的確定

‘粉玉奴’爲芍藥早花品種，整體花期爲４ 月２５日─５ 月３ 日，較爲集中，４ 月２８ 日進入盛花期；芍藥露色期較長，１ 周左右；鬆雷─大蕾─開放的過程需要１～２ ｄ，個體之間差異明顯，部分花朵從鬆蕾到開放只需１２ ｈ；盛花期４～６ ｄ；盛開的花朵每天１６：３０左右開始出現閉合的趨勢，花瓣合攏。花葯在開放第１ ｄ 時陸續開裂散粉，但是也有少部分個體在花未完全開放即大蕾期就已經散粉，因此，去雄套袋工作要在鬆蕾期及時完成。

母本‘粉玉奴’花朵柱頭在花開放第２ 天開始分泌黏液，隨着時間增加，黏液分泌量逐漸增多，但是第２～３ 天個體差異較大，第５ 天黏液分泌量達到最大，隨後逐漸減少，第７ 天柱頭部分個體有黏液分泌，第８ 天的柱頭沒有觀察到黏液。

2．2 雜交親本花粉的掃描電鏡觀察

遠緣雜交親本花粉粒形態差異直接影響花粉在柱頭上的黏附。通過掃描電鏡觀察到牡丹品種‘鳳丹白’與芍藥品種‘粉玉奴’花粉粒形態有相似性，由表２ 可知，二者均爲中型花粉，花粉粒大小差異不明顯。花粉粒形狀爲長球形，赤道面觀爲長橢圓形，極面觀爲三裂圓形，具三擬孔溝，具溝膜。但是在細部特徵上略有差異，‘鳳丹白’表面紋飾爲細網狀紋飾，極面平截，網眼多邊形少圓形，網眼頻率較高，網眼直徑大於網脊寬度，而芍藥表面紋飾爲穴網狀紋飾，極面平滑，網眼頻率較低，網眼直徑小於網脊寬度。母本花粉畸形率遠大於父本，‘鳳丹白’花粉畸形率較低，適合授粉。

2．3 遠緣雜交結實率與芍藥自然授粉結實率對比

牡丹與芍藥遠緣雜交表現出嚴重的不親和性，授粉５７９ 朵，結果數３０，獲得種子４９ 粒，結果率５．２％。在開花期標記３００ 個芍藥花朵，果熟期統計標記花朵的結果數爲２２８，芍藥的自然結實率爲７６％。#p#分頁標題#e#

2．4 遠緣雜交授粉後花粉管的顯微觀察

人工授粉後‘鳳丹白’花粉能夠在芍藥柱頭上正常萌發，但是達到最大萌發量的時間比離體培養所用的時間長，部分花粉管能夠伸入柱頭，最遠可伸入到花柱１／２ 處，未見花粉管穿過花柱進入子房，完成受精。花粉萌發和花粉管伸長受到了一些阻礙。具體表現爲授粉８ ｈ 後觀察到有花粉黏附到柱頭，少數花粉萌發，花粉管伸長；授粉１６ ｈ 後花粉萌發個數明顯增加，花粉管繼續伸長，但未伸入柱頭，柱頭乳突細胞產生胼胝質反應；授粉２４ ｈ 後花粉萌發量達到最高，這與律春燕等［１６］ 的研究一致。但是花粉管存在不同形式的畸形，尖端異常膨大，有的花粉管在柱頭表面出現纏繞、扭曲、腫脹、結合、分枝等現象，並有部分花粉管伸長遲緩；授粉４８ ｈ 後，觀察到有少量花粉進入柱頭，花粉管成束狀向花柱延伸，柱頭上積累的胼胝質成散點狀分佈；授粉７２～９６ ｈ，萌發的花粉數逐漸減少，胼胝質積累持續增加。

3 結論與討論

遠緣雜交的成功依賴於植物傳粉受精過程中每一個環節，從花粉粒的附着、萌發，花粉管的生長，雙受精的完成，到合子、胚乳的發育等，其中任何一個環節發生障礙，都會直接導致雜交的失敗 。因此，授粉前親本花粉育性 、雌蕊發育狀況 ，授粉後花粉在柱頭萌發及花粉管生長情況 ，對雜交結實率有很大的影響。

本試驗通過對母本‘粉玉奴’開花特性和柱頭分泌黏液情況的觀察，確定開花後第２～６ ｄ 爲柱頭的可授期，開花後第４～５ ｄ 可授性最強，黏液能夠黏住花粉，這與紅雨等 的研究結果略有差異，推測可能是由於栽培地氣候環境不同所致。結合母本開花的習性，雜交授粉工作應該在母本鬆蕾期或大蕾期去雄套袋，在套袋４ ｄ 後進行人工授粉。#p#分頁標題#e#

本研究結果顯示，‘鳳丹白’與‘粉玉奴’遠緣雜交存在受精前隔離，即雜交不親和。雜交父母本自身結實率均較高，且授粉前父本花粉生活力較高，而且能夠在母本柱頭上正常黏附，花粉也可萌發生長，這表明雜交親本均具有可育性。但是花粉與柱頭的相互識別作用，導致一系列的胼胝質反應阻礙花粉管的穿行，使其無法進入花柱，伸入子房完成受精作用。在花粉萌發的熒光觀察試驗中發現，花粉管與花柱內大量胼胝質積累，花粉管在伸長過程中出現纏繞、扭曲、腫脹、結合、分枝等現象，授粉４８ｈ 後，僅有少量花粉管生長到花柱１／２ 處，未能完成受精。這與律春燕 、王文和 、陳偉峯 等觀察到的現象相似。李守麗等對大百合與百合屬間雜交授粉後花粉管的行爲進行了觀察，百合的花粉萌發與花粉管的伸長速度相對於自交滯後，個別花粉管出現末端分叉、膨大或變細或中間部分摺疊，花粉管內胼胝質不規則的大量沉積，這些識別反應導致結實率低。因此，受精前障礙是遠緣雜交結實率低的重要原因，授粉後花粉管正常生長並穿過柱頭是牡丹芍藥遠緣雜交較高結實率的重要保障。在今後的雜交育種工作中可以嘗試採取花粉蒙導、藥劑塗抹柱頭、花柱短截、試管受精等方法開展牡丹芍藥遠緣雜交試驗。

本試驗通過‘鳳丹白’與‘粉玉奴’遠緣雜交，得到了少量的種子，雖然雜交親和性與花粉管的行爲有關，雜交的成功與否還受到受精後胚胎與胚乳發育的影響。關於受精後障礙、胚胎髮育、雜交種子的萌發等方面還要從胚胎學和遺傳學方面進一步探討研究。